TIANSeq mRNA ta'qib qilish to'plami

Hozirgi vaqtda yuqori o'tkazuvchanlik ketma-ketligi texnologiyasi asosan keyingi avlod sekansirovka texnologiyasiga asoslangan. Keyingi avlod ketma -ketligi texnologiyasining o'qish uzunligi cheklanganligi sababli, biz to'liq uzunlik ketma -ketligini kichik qismli kutubxonalarga ajratishimiz kerak. Turli xil ketma-ketlik tajribalarining ehtiyojlariga ko'ra, biz odatda bitta uchli ketma-ketlikni yoki ikki tomonlama ketma-ketlikni tanlaymiz. Hozirgi vaqtda keyingi avlod kutubxonasining DNK bo'laklari odatda 200-800 bp oralig'ida taqsimlangan.

a) DNKning sifati past va tarkibida ingibitorlar bor. Ferment faolligini inhibe qilmaslik uchun yuqori sifatli DNK namunalaridan foydalaning.

b) DNK kutubxonasini qurish uchun PCRsiz usulni qo'llashda DNK namunasining miqdori etarli emas. Parchalangan DNKning kiritilishi 50 ng dan oshganda, kutubxonani qurish jarayonida PCRsiz ish oqimi tanlab bajarilishi mumkin. Agar kutubxonaning nusxa ko'chirish raqami to'g'ridan -to'g'ri ketma -ket bo'lishi uchun juda past bo'lsa, DNK kutubxonasi adapterni bog'lagandan so'ng PCR yordamida kuchaytirilishi mumkin.

c) RNKning ifloslanishi noaniq boshlang'ich DNK miqdoriga olib keladi Genomik DNKni tozalash jarayonida RNKning ifloslanishi bo'lishi mumkin, bu esa DNKning noto'g'ri aniqlanishiga va kutubxona qurilishida DNKning etarli yuklanishiga olib kelishi mumkin. RNKni RNase bilan davolash orqali olib tashlash mumkin.

A-1

a) Kichik bo'laklar (60 bp-120 bp) paydo bo'ladi Kichik bo'laklar odatda adapter qismlari yoki adapterlar tomonidan yaratilgan dimerlardir. Agencourt AMPure XP magnit boncuklari bilan tozalash bu adapter qismlarini samarali olib tashlashi va ketma -ketlik sifatini ta'minlashi mumkin.

b) PCR kuchaytirilgandan keyin kutubxonada katta bo'laklar paydo bo'ladi Adapterni bog'lagandan so'ng kutubxonaning DNK fragmentining o'lchami 120 bp ga oshadi. Agar adapterning bog'lanishidan keyin DNK bo'lagi 120 bp dan oshsa, bu PCRning haddan tashqari ko'payishining g'ayritabiiy parchalanishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. PCR tsikllari sonini kamaytirish vaziyatni oldini oladi.

c) Adapterni ulashdan keyin kutubxona DNK fragmentlarining g'ayritabiiy hajmi Ushbu to'plamdagi adapterning uzunligi 60 bp. Fragmanning ikki uchi adapterga bog'langanda, uning uzunligi atigi 120 bp ga oshadi. Agar siz ushbu to'plamdan boshqa adapterdan foydalansangiz, adapterning uzunligi kabi tegishli ma'lumotlarni taqdim etish uchun etkazib beruvchiga murojaat qiling. Iltimos, eksperimentning bajarilishi va qo'llanmasi yo'riqnomada tasvirlangan amallarni bajarishiga ishonch hosil qiling.

d) Adapterni ulashdan oldin DNK fragmentining g'ayritabiiy o'lchami Bu muammoning sababi DNK parchalanishidagi noto'g'ri reaktsiya sharoitlari bo'lishi mumkin. Har xil DNK kiritish uchun har xil reaktsiya vaqtidan foydalanish kerak. Agar DNK kiritilishi 10 ng dan yuqori bo'lsa, biz optimallashtirish uchun boshlang'ich vaqt sifatida 12 min reaksiya vaqtini tanlashni tavsiya qilamiz va bu vaqtda ishlab chiqarilgan parcha kattaligi asosan 300-500 bp oralig'ida bo'ladi. Foydalanuvchilar kerakli o'lchamdagi DNK bo'laklarini optimallashtirish uchun o'z talablariga muvofiq DNK fragmentlarining uzunligini 2-4 minutga uzaytirishi yoki kamaytirishi mumkin.

A-2

a) Parchalanish vaqti optimallashtirilmagan, agar bo'laklangan DNK juda kichik yoki juda katta bo'lsa, iltimos, reaktsiya vaqtini aniqlash uchun yo'riqnomada berilgan bo'linish vaqtini tanlash bo'yicha ko'rsatmalarga qarang va bu vaqt nuqtasini nazorat sifatida ishlating. Parchalanish vaqtini aniqroq sozlash uchun reaktsiya tizimi 3 minutni uzaytiradi yoki qisqartiradi.

A-3

Parchalanish davosidan keyin DNKning g'ayritabiiy o'lchamdagi taqsimlanishi

a) parchalanish reagentining noto'g'ri eritish usuli yoki eriganidan keyin reagent to'liq aralashmaydi. Muz ustida 5 × Fragmentation Enzyme Mix reagentini eritib oling. Eritgandan so'ng, reaktivni naychaning pastki qismini sekin siltab, teng ravishda aralashtiring. Reaktivni aylantirmang!

b) DNK kiritish namunasi EDTA yoki boshqa ifloslantiruvchi moddalarni o'z ichiga oladi. DNKni tozalash bosqichida tuz ionlari va xelatlovchi moddalarning emirilishi tajribaning muvaffaqiyati uchun ayniqsa muhimdir. Agar DNK 1 × TEda erigan bo'lsa, parchalanishni bajarish uchun yo'riqnomada ko'rsatilgan usuldan foydalaning. Agar eritmadagi EDTA kontsentratsiyasi noaniq bo'lsa, keyingi reaktsiya uchun DNKni tozalash va deionizatsiyalangan suvda eritish tavsiya etiladi.

v) noaniq boshlang'ich DNK miqdori Parchalangan DNKning kattaligi DNK kiritgan miqdori bilan chambarchas bog'liq. Parchalanish bilan davolashdan oldin, reaktsiya tizimidagi DNKning aniq miqdorini aniqlash uchun Qubit, Picogreen va boshqa usullar yordamida DNKning aniq miqdorini aniqlash zarur.

 d) Reaksiya tizimini tayyorlash yo'riqnomaga mos kelmaydi. Parchalangan reaktsiya tizimini tayyorlash ko'rsatmalarga muvofiq qat'iy ravishda muz ustida bajarilishi kerak. Eng yaxshi ta'sirni ta'minlash uchun barcha reaktsiya komponentlarini muzga qo'yish kerak va to'liq sovutgandan so'ng reaktsiya tizimini tayyorlash kerak. Tayyorgarlik tugagandan so'ng, yaxshilab aralashtirish uchun siljiting yoki pipetka bilan suring. Vorteks qilmang!

1. Noto'g'ri aralashtirish usuli (girdob, zo'ravon tebranish va boshqalar) kutubxona qismlarining g'ayritabiiy taqsimlanishiga olib keladi (quyidagi rasmda ko'rsatilgandek) va shu tariqa kutubxona sifatiga ta'sir qiladi. Shuning uchun, "Fragmentation Mix" reaktsiyasi eritmasini tayyorlayotganda, iltimos, yuqoriga va pastga pipetka bilan aralashtiring yoki barmoq uchi bilan silliq siljiting va aralashtiring. Vorteks bilan aralashmaslik uchun ehtiyot bo'ling.

2. Kutubxona qurish uchun yuqori poklikdagi DNKdan foydalanish kerak

■ DNKning yaxlitligi: elektroforez diapazoni 30 kb dan ortiq, quyruqsiz

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. DNK kiritish miqdori aniq bo'lishi kerak DNK miqdorini aniqlash uchun Nanodrop emas, balki Qubit va PicoGreen usullaridan foydalanish tavsiya etiladi.

4. DNK eritmasidagi EDTA tarkibini aniqlash kerak EDTA parchalanish reaktsiyasiga katta ta'sir ko'rsatadi. Agar EDTA tarkibi yuqori bo'lsa, keyingi testdan oldin DNKni tozalash kerak.

5. Parchalanish reaktsiyasi eritmasi muz ustida tayyorlanishi kerak. Parchalanish jarayoni reaktsiya harorati va vaqtiga sezgir (ayniqsa kuchaytirgich qo'shilgandan keyin). Reaksiya vaqtining aniqligini ta'minlash uchun, iltimos, muz ustida reaktsiya tizimini tayyorlang.

6. Parchalanish reaktsiyasi vaqti aniq bo'lishi kerak. Parchalanish bosqichining reaktsiya vaqti to'g'ridan -to'g'ri parcha mahsulotlarining hajmiga ta'sir qiladi va shu tariqa kutubxonadagi DNK bo'laklari hajmining taqsimlanishiga ta'sir qiladi.

1. Ushbu to'plamga qanday turdagi namuna qo'llaniladi?

Ushbu to'plamning qo'llaniladigan namunaviy turi umumiy RNK yoki yaxshi RNK yaxlitligi bilan tozalangan mRNK bo'lishi mumkin. Agar kutubxonani qurish uchun umumiy RNK ishlatilsa, avval rRNKni olib tashlash uchun rRNKni yo'q qilish to'plamidan foydalanish tavsiya etiladi (Cat#4992363/4992364/4992391).

2. FFPE namunalarini ushbu to'plam yordamida kutubxona qurish uchun ishlatish mumkinmi?

FFPE namunalaridagi mRNA ma'lum darajada yomonlashadi, yaxlitligi nisbatan yomon. Kutubxona qurilishi uchun ushbu to'plamdan foydalanganda, parchalanish vaqtini optimallashtirish tavsiya etiladi (parchalanish vaqtini qisqartirish yoki bo'linishni bajarmaslik).

3. Mahsulot qo'llanmasida berilgan o'lchamlarni tanlash bosqichidan foydalanib, kiritilgan segment engil burilish paydo bo'lishiga nima sabab bo'lishi mumkin?

O'lchamlarni tanlash ushbu mahsulot qo'llanmasidagi o'lchamlarni tanlash bosqichiga qat'iy muvofiq amalga oshirilishi kerak. Agar burilish bo'lsa, buning sababi shundaki, magnit boncuklar xona haroratiga tenglashtirilmagan yoki to'liq aralashmagan, pipetka aniq emas yoki uchida suyuqlik qolgan bo'lishi mumkin. Tajriba uchun past adsorbsiyali maslahatlardan foydalanish tavsiya etiladi.

4. Kutubxona qurilishida adapterlarni tanlash

Kutubxona qurilish to'plamida adapter reaktivi yo'q va bu to'plamni TIANSeq bitta indeksli adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378) bilan birgalikda ishlatish tavsiya etiladi.

5. Kutubxonaning sifat ko'rsatkichlari

Kutubxonaning miqdoriy aniqlanishi: Qubit va qPCR mos ravishda kutubxonaning massa va molyar kontsentratsiyasini aniqlash uchun ishlatiladi. Amaliyot qat'iy ravishda mahsulot qo'llanmasiga muvofiq amalga oshiriladi. Kutubxonaning kontsentratsiyasi odatda NGS tartiblash talablariga javob beradi. Kutubxona tarqatish diapazonini aniqlash: Kutubxonaning tarqatish diapazonini aniqlash uchun Agilent 2100 Bioanalyzer yordamida.

6. Kuchaytiruvchi tsikl raqamini tanlash

Ko'rsatmalarga ko'ra, PCR tsikllari soni 6-12 ni tashkil qiladi va kerakli PCR tsikllari namunaviy kirishga qarab tanlanishi kerak. Yuqori mahsuldorlikdagi kutubxonalarda, odatda, har xil darajalarda ko'payish kuzatiladi, bu Agilent 2100 Bioanalizatorni aniqlashda maqsadli diapazonning eng yuqori cho'qqisidan keyin yoki Qubitning aniqlangan kontsentratsiyasi qPCR ga qaraganda pastroq bo'lganidan keyin biroz kattaroq cho'qqisi bilan namoyon bo'ladi. Kuchaytirmaslik - bu oddiy hodisa, bu kutubxona ketma -ketligi va keyingi ma'lumotlarni tahlil qilishga ta'sir qilmaydi.

7. Spikes Agilent 2100 Bioanalyzerni aniqlash profilida paydo bo'ladi

Agilent 2100 Bioanalyzerni aniqlashda paychalarning paydo bo'lishi namuna notekis bo'laklarga bo'linadi, bu erda ma'lum o'lchamdagi bo'laklar ko'proq bo'ladi va bu PCRni boyitgandan keyin aniqroq bo'ladi. Bunday holda, o'lchamlarni tanlashni bajarmaslik, ya'ni parchalanish shartini 94 ° C ga 15 min inkubatsiyaga qo'yish tavsiya etiladi, bu erda bo'laklarning tarqalishi kichik va konsentratsiyalangan bo'ladi va bir xillikni yaxshilash mumkin.