To'g'ridan -to'g'ri PCR to'plami

A-1 shablon

■ Andoza tarkibida oqsil aralashmalari yoki Taq ingibitorlari va boshqalar mavjud. - DNK shablonini tozalang, oqsil aralashmalarini olib tashlang yoki tozalash to'plamlari yordamida DNK shablonini oling.

■ Shablonning denaturatsiyasi to'liq emas - Denaturatsiya haroratini mos ravishda oshiring va denaturatsiya vaqtini uzaytiring.

■ Andoza degradatsiyasi-shablonni qayta tayyorlang.

A-2 astar

■ Astarlarning sifati past--astarni qayta sintez qiling.

■ Primer degradatsiyasi - Konserva qilish uchun yuqori konsentratsiyali primerlarni kichik hajmga bo'ling. Ko'p muzlatish va eritishdan saqlaning yoki uzoq vaqt davomida 4 ° C haroratda saqlang.

■ Astarlarning noto'g'ri dizayni (masalan, astar uzunligi etarli emas, primerlar o'rtasida dimer hosil qilingan va hokazo) -Qayta loyihalash primerlari (primer dimer va ikkilamchi tuzilish shakllanishiga yo'l qo'ymaslik)

A-3 mg²⁺diqqat

■ Mg²⁺ konsentratsiyasi juda past - Mg ni muntazam oshirib boring²⁺ konsentratsiyasi: Mg ni optimallashtirish²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

A-4 Tozalash harorati

■ Yuqori tavlanish harorati astar va shablonni bog'lashga ta'sir qiladi. —- Yonish haroratini pasaytiring va 2 ° C gradiyentli holatni optimallashtiring.

A-5 uzaytirish muddati

■ Qisqa muddat - - uzaytirish vaqtini ko'paytirish.

Fenomenlar: Salbiy namunalar maqsadli ketma -ketlik tasmalarini ham ko'rsatadi.

A-1 PCRning ifloslanishi

■ Maqsadli ketma -ketlik yoki kuchaytiruvchi mahsulotlarning o'zaro ifloslanishi - salbiy namunadagi maqsadli ketma -ketlikdagi namunani naychalash yoki ularni santrifüj trubasidan to'kib yubormaslik. Reaktivlar yoki uskunalar mavjud nuklein kislotalarni yo'q qilish uchun avtoklavda bo'lishi kerak va ifloslanishning mavjudligini salbiy nazorat tajribalari orqali aniqlash kerak.

■ Reaktivlar bilan ifloslanish - reaktivlarni ko'paytirish va past haroratda saqlash.

A-2 boshr

■ Mg²⁺ konsentratsiyasi juda past - Mg ni muntazam oshirib boring²⁺ konsentratsiyasi: Mg ni optimallashtirish²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

■ Noto'g'ri astar dizayni va maqsadli ketma-ketlik nodavlat ketma-ketlik bilan gomologiyaga ega. —- Qayta dizayndagi astarlar.

Fenomenlar: PCR amplifikatsiya diapazonlari kutilgan hajmga mos kelmaydi, ham katta, ham kichik, yoki ba'zida o'ziga xos kuchaytiruvchi diapazonlar ham, o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish tasmalari ham paydo bo'ladi.

A-1 astar

■ Primerning o'ziga xosligi past

—- Qayta dizayndagi astar.

■ Primer kontsentratsiyasi juda yuqori - denaturatsiya haroratini to'g'ri oshiring va denaturatsiya vaqtini uzaytiring.

A-2 mg²⁺ diqqat

■ Mg²⁺ konsentratsiya juda yuqori - Mg2+ konsentratsiyasini to'g'ri kamaytiring: Mg ni optimallashtiring²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

A-3 termostabil polimeraza

■ Ortiqcha ferment miqdori - 0,5 U oralig'ida ferment miqdorini mos ravishda kamaytiring.

A-4 Tozalash harorati

■ Qovurish harorati juda past--Tavlanish haroratini mos ravishda oshiring yoki ikki bosqichli tavlanish usulini qo'llang.

A-5 PCR tsikllari

■ PCR tsikllari juda ko'p - PCR tsikllari sonini kamaytiring.

A-1 astar—— Yomon o'ziga xoslik--Astarni qayta loyihalash, o'ziga xosligini oshirish uchun uning o'rnini va uzunligini o'zgartirish; yoki joylashtirilgan PCRni bajaring.

A-2 DNK shablonni

—– Shablon toza emas - Shablonni tozalang yoki DNKni tozalash to'plamlari bilan chiqarib oling.

A-3 mg²⁺ diqqat

——Mg²⁺ konsentratsiyasi juda yuqori - Mgni to'g'ri kamaytiring²⁺ konsentratsiyasi: Mg ni optimallashtirish²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

A-4 dNTP

DNTP konsentratsiyasi juda yuqori - DNTP konsentratsiyasini mos ravishda kamaytiring

A-5 Tozalash harorati

—- Juda past tavlanish harorati —- Tavlanish haroratini mos ravishda oshiring

A-6 davrlari

—— Juda ko'p tsikl - - Tsikl sonini optimallashtiring

Birinchi qadam - tegishli polimeraza tanlash. Muntazam Taq polimeraza 3'-5 'ekzonukleaza faolligi yo'qligi sababli tekshira olmaydi va mos kelmaslik parchalarning kengayish samaradorligini ancha pasaytiradi. Shuning uchun muntazam Taq polimeraza 5 kb dan katta maqsadli bo'laklarni samarali ravishda kuchaytira olmaydi. Maxsus modifikatsiyali yoki boshqa yuqori aniqlikdagi polimerazali tak polimeraza kengayish samaradorligini oshirish va uzun bo'laklarni kuchaytirish ehtiyojlarini qondirish uchun tanlanishi kerak. Bundan tashqari, uzun bo'laklarni kuchaytirish uchun primer konstruktsiyasini, denaturatsiya vaqtini, uzaytirish vaqtini, bufer pH ni va boshqalarni moslashtirish talab qilinadi. Shabloni shikastlanishining oldini olish uchun, 94 ° C haroratda denaturatsiya vaqti har bir tsiklda 30 sekundgacha yoki undan kamgacha kamaytirilishi kerak, va kuchaytirishdan oldin haroratni 94 ° C ga ko'tarish vaqti 1 minutdan kam bo'lishi kerak. Bundan tashqari, cho'zish haroratini taxminan 68 ° C darajasida o'rnatish va 1 kb/min tezlik bo'yicha uzaytirish vaqtini loyihalash uzun bo'laklarning samarali kuchayishini ta'minlaydi.

PCR amplifikatsiyasining xato tezligini turli xil DNK polimerazalari yordamida yuqori aniqlik bilan kamaytirish mumkin. Hozirgacha topilgan Taq DNK polimerazalari orasida Pfu fermenti xato darajasi past va ishonchliligi yuqori (biriktirilgan jadvalga qarang). Tadqiqotchilar fermentlarni tanlashdan tashqari, reaksiya sharoitlarini optimallashtirish, shu jumladan bufer tarkibini, termostabil polimeraza kontsentratsiyasini va PCR tsiklini optimallashtirish orqali PCR mutatsiyasini tezligini kamaytirishi mumkin.