FastKing RT to'plami (gDNase bilan)

A-1 RNK parchalanadi

—– Yuqori sifatli RNKni ifloslanmagan holda tozalang. RNK degradatsiyasini oldini olish uchun RNK olinadigan material iloji boricha yangi bo'lishi kerak. RT reaktsiyasidan oldin denaturatsiyalangan gel bo'yicha RNK yaxlitligini tahlil qiling. RNK ekstraktsiyasidan so'ng uni 100% formamidda saqlash kerak. Agar RNaz inhibitori ishlatilsa, isitish harorati <45 ° C, pH 8,0 dan past bo'lishi kerak, aks holda ingibitor barcha bog'langan RNazani chiqaradi. Bundan tashqari, 0,8 mM DTT o'z ichiga olgan eritmalarga RNaz inhibitori qo'shilishi kerak.

A-2 RNK tarkibida teskari transkripsiya reaktsiyalarining ingibitorlari mavjud

—— Teskari transkripsiya inhibitörleri tarkibiga SDS, EDTA, glitserin, natriy pirofosfat, spermidin, formamid, guanidin tuzi va boshqalar kiradi. Nazorat qiluvchi RNKni namuna bilan aralashtiring va rentabellikni nazorat qiluvchi RNK reaktsiyasi bilan solishtirib, ingibitor borligini tekshiring. Inhibitorlarni olib tashlash uchun RNK yog'inlarini 70% (v/v) etanol bilan yuving.

A-3 cDNKning birinchi zanjirini sintez qilish uchun ishlatiladigan astarlarni tavlanishi etarli emas

——Tavish temperaturasi tajribada ishlatiladigan astarlarga mos kelishini aniqlang. Tasodifiy hexamerlar uchun, reaksiya haroratiga yetguncha haroratni 25 ° C da 10 minut ushlab turish tavsiya etiladi. Genga xos primerlar (GSP) uchun boshqa GSP ni ishlating yoki oligo (dT) yoki tasodifiy geksamerga o'ting.

A-4 Kichik miqdordagi boshlang'ich RNK

—— RNK miqdorini oshiring. 50 ng dan kam bo'lgan RNK namunalari uchun birinchi zanjir cDNA sintezida 0,1 mkg dan 0,5 mkg gacha asetil BSA ishlatilishi mumkin.

A-5 Maqsadli ketma-ketlik tahlil qilingan to'qimalarda ifodalanmaydi.

—— Boshqa to'qimalarni sinab ko'ring.

A-6 PCR reaktsiyasi muvaffaqiyatsiz tugadi

—- Ikki bosqichli RT-PCR uchun, PCR bosqichidagi cDNA shabloni reaktsiya hajmining 1/5 qismidan oshmasligi kerak.

A-1 Astarlar va shablonlarni o'ziga xos bo'lmagan tavlanishi

——3-uchli primerlarda 2-3 dG yoki dC bo'lmasligi kerak. Tasodifiy primerlar yoki oligo (dT) o'rniga birinchi qator sintezida genga xos primerlardan foydalaning. Dastlabki davrlarda yuqori tavlanish haroratidan foydalaning, keyin esa pastroq tavlanish haroratidan foydalaning. Reaksiyaning o'ziga xosligini yaxshilash uchun PCR uchun issiq boshlanadigan Taq DNK polimerazasidan foydalaning.

A-2 Genlarga xos primerlarning yomon dizayni

Primer dizaynini kuchaytirish uchun xuddi shu printsiplarga amal qiling.

A-3 RNK genomik DNK bilan ifloslangan

—RNKni PCR darajali DNaz I bilan davolang. DNKning ifloslanishini aniqlash uchun teskari transkripsiyasiz nazorat reaktsiyasini o'rnating.

A-4 Primer dimerning shakllanishi

- 3 -uchida bir -birini to'ldiruvchi ketma -ketliksiz astarlarni loyihalash.

A-5 juda yuqori Mg²⁺ diqqat

- Mg ni optimallashtirish²⁺ har bir shablon va primer kombinatsiyasi uchun kontsentratsiya

A-6 Chet ellik DNK bilan ifloslangan

—— Aerozolga chidamli maslahatlar va UDG fermentlaridan foydalaning.

A-1 Birinchi tolali mahsulotning tarkibi juda yuqori

—— An'anaviy PCR reaktsiya bosqichida birinchi qatorli mahsulot miqdorini kamaytiring.

A-2 PCR reaktsiyasida primer miqdori juda yuqori

—— Primer kirishni kamaytiring.

A-3 Juda ko'p tsikl

- PCR reaktsiyasi shartlarini optimallashtirish va PCR tsikli sonini kamaytirish.

A-4 Juda past tavlanish harorati

—- Nonspesifik ishga tushirish va uzayishning oldini olish uchun tavlanish haroratini oshiring.

A-5 DNKning DNaz degradatsiyasi natijasida hosil bo'lgan oligonukleotid bo'laklarining o'ziga xos bo'lmagan kuchayishi-DNKning ifloslanishini oldini olish uchun yuqori sifatli RNKni chiqarib oling.

RT-PCR-bu RNKni cDNA-ga teskari transkripsiya qilish, so'ngra maqsadli bo'lakni kuchaytirish uchun PCR reaktsiyasi uchun shablon sifatida teskari transkripsiya qilingan cDNA-dan foydalanish. Tajribaning o'ziga xos shartlariga muvofiq tasodifiy primerlarni, Oligo dT va genga xos primerlarni tanlang. Yuqoridagi barcha primerlar soch qisqichlari tuzilmasi bo'lmagan qisqa eukaryotik hujayrali mRNK uchun ishlatilishi mumkin.

Tasodifiy primer: RPK, mRNK, tRNK va boshqalar kabi har xil turdagi RNKlar, shuningdek, bitta shablonning RT-PCR reaktsiyasi uchun ishlatiladi.

Oligo dT: PolyA quyruqli RNK uchun mos (prokaryotik RNK, eukaryotik Oligo dT rRNK va tRNKda PolyA dumlari yo'q). Oligo dT PolyA dumiga bog'langanligi sababli, RNK namunalarining sifati yuqori bo'lishi talab qilinadi va hatto ozgina degradatsiya ham to'liq uzunlikdagi cDNA sintezini kamaytiradi.

Genga xos primer: shablon ketma-ketligini to'ldiruvchi, maqsadli ketma-ketlik ma'lum bo'lgan holatlarga mos keladi.

Ikkita yo'l bor:

1. Ichki mos yozuvlar usuli: Nazariy jihatdan, cDNA - har xil uzunlikdagi DNK bo'laklari, shuning uchun elektroforez natijasi - smear. Agar RNK miqdori past bo'lsa, elektroforezda hech qanday mahsulot ko'rsatilmaydi, lekin bu hech qanday mahsulotni PCR yordamida kuchaytirmaydi degani emas. Umuman olganda, cDNA ni aniqlash uchun ichki ma'lumotlardan foydalanish mumkin. Agar ichki ma'lumotnomada natijalar bo'lsa, cDNA sifatiga asosan kafolat berilishi mumkin (ba'zi hollarda, agar maqsad gen fragmenti juda uzun bo'lsa, istisnolar bo'lishi mumkin).

2. Agar bu shablon yordamida kuchaytirilgan ma'lum gen bo'lsa, uni bu genning primerlari tasdiqlashi mumkin. Ichki ma'lumotnomaning kuchayishi, albatta, cDNA bilan hech qanday muammo yo'q degani emas. Ichki ma'lumotnoma cDNA -da ko'p miqdorda bo'lgani uchun uni ko'paytirish oson. Agar cDNA turli sabablarga ko'ra qisman tanazzulga uchragan bo'lsa, ehtimollik nuqtai nazaridan, maqsadli genlarning past miqdori PCR natijalariga katta ta'sir ko'rsatadi. Ichki ma'lumotnoma hali ham ko'p bo'lsa -da, kuchaytirilishiga ta'sir qilmasligi mumkin.

RNKning qisman degradatsiyasi. RNKning yaxlitligini aniqlang va tozalang

Turli xil turlarning RNK tarkibi boshqacha bo'lishi mumkin, lekin umuman olganda, ajratilgan umumiy RNK tarkibida jel elektroforezda ikkita 28S va 18S aniq tasmalar bo'lishi kerak, va oldingi tasma yorqinligi ikkinchisidan ikki baravar yuqori bo'lishi kerak. 5S diapazoni RNK degradatsiyasini ko'rsatadi va uning yorqinligi degradatsiya darajasiga mutanosib. Ichki ma'lumotnomaning muvaffaqiyatli kuchaytirilishi RNK bilan hech qanday muammo yo'q degani emas, chunki ichki mos yozuvlar juda ko'p, degradatsiya kuchli bo'lmasa, RNKni kuchaytirish mumkin. OD₂₆₀/OD₂₈₀Spektrofotometr bilan o'lchanadigan sof RNK nisbati 1,9 dan 2,1 gacha bo'lishi kerak. RNKdagi oz miqdordagi oqsil aralashmasi bu nisbatni pasaytiradi. Agar qiymat juda past bo'lmasa, RT ta'sir qilmaydi. RT uchun eng muhim narsa bu RNKning yaxlitligi.

Ichki mos yozuvlar genining kengayishi faqat RT muvaffaqiyatli bo'lganligini ko'rsatishi mumkin, lekin bu albatta cDNA zanjirining sifati bilan bog'liq emas. Ichki mos yozuvlar bo'laklari odatda kichik o'lchamli va yuqori ifodali bo'lgani uchun ularni teskari transkripsiya qilishda muvaffaqiyat qozonish osonroq bo'ladi. Biroq, maqsadli genning hajmi va ifodasi har bir gendan farq qiladi. CDNA sifatini faqat ichki ma'lumot bilan baholab bo'lmaydi, ayniqsa 2 kb dan ortiq maqsadli fragmentlar uchun.

Ba'zi namunalar murakkab ikkilamchi tuzilishga ega yoki GC tarkibiga boy yoki kam miqdorda qimmatlidir. Bunday hollarda, maqsadli bo'lak va namuna hajmiga qarab, mos keladigan teskari transkriptaza tanlanishi kerak. Yuqori GC tarkibli va murakkab ikkilamchi tuzilishga ega RNK shablonlari uchun past haroratda yoki umumiy teskari transkriptaza bilan ikkilamchi tuzilmani ochish qiyin. Bu andozalar uchun teskari transkriptazani tanlash mumkin, chunki uning teskari transkripsiya ko'rsatkichi M-MLV seriyali teskari transkriptazaga qaraganda yaxshiroqdir, bu turli RNK shablonlarini samarali tarzda teskari o'zgartirishi va RNKni birinchi darajali cDNA ga transkripsiya qilishi mumkin. Umumiy teskari transkriptaza to'plamidan foydalanganda, 20 ml tizim faqat 1 mkg umumiy RNKni transkripsiya qila oladi. Iltimos, to'plamning maksimal RT hajmiga e'tibor bering. Agar shablon ortiqcha qo'shilsa, teskari transkripsiya RNKni ko'p miqdorda beradi. Shuning uchun, tizimning maksimal quvvatidan oshmaslik yaxshiroqdir.

A-1 RNK jiddiy darajada buzilganligini va RT muvaffaqiyatli bo'lganligini aniqlang

Umuman olganda, ichki mos yozuvlar amplifikatsiyasining muvaffaqiyatsizligining sababi ko'pincha RNKning jiddiy degradatsiyasi bilan bog'liq. Boshqa mumkin bo'lgan sabab - teskari transkripsiya buzilishi. CDNA bitta ipining sifatini baholash uchun ichki ma'lumotni standart sifatida ishlatish mumkin emas, lekin agar RNK sifatida muammo bo'lmasa, teskari transkripsiya muvaffaqiyatli yoki yo'qligini aniqlash uchun standart sifatida foydalanish mumkin. Teskari transkripsiya jarayonida eng muhimi, reaksiya samaradorligini oshirish uchun doimiy harorat va doimiy reaktsiya tizimini saqlab turishdir.

A-2 Ichki mos yozuvlar genlarini kuchaytirish uchun primerlar ishonchli yoki yo'qligini va PCRda ishlatiladigan reagentlar bilan bog'liq muammolar mavjudligini aniqlang.

Nisbiy miqdorni aniqlash uchun RNKni teskari transkripsiya qilishdan oldin miqdorini aniqlash kerak, bu ko'p teskari transkripsiya to'plamlarida ham talab qilinadi, masalan, RNK kirishini 1 mkg sifatida aniqlang. Teskari transkripsiya qilingan cDNA aralash eritma, shu jumladan RNK, oligo dT, ferment, dNTP va hatto ozgina DNK qoldig'i bo'lgani uchun, og'ish paydo bo'ladi, shuning uchun cDNA ni aniq sonini aniqlab bo'lmaydi. Shuning uchun RNK miqdorini aniqlash zarur. Har xil namunalarda teskari transkripsiya samaradorligi bir xil ekanligini hisobga olsak, olingan cDNA miqdori bir xil bo'lishi kerak va miqdoriy tahlil bir xil miqdordagi umumiy RNKdagi turli genlarning ekspressiya darajasini solishtirishni ko'rsatishi mumkin. Nisbiy floresansli miqdoriy PCRni bajarishda teskari transkripsiyadan so'ng miqdoriy cDNA kerak bo'lmasligi mumkin, chunki ichki mos yozuvlar geni mos yozuvlar sifatida ishlay oladi.

Bu asosan genlar bilan bog'liq va uzun bo'lakning teskari transkripsiyasi ko'pchilik genlar uchun mumkin emas. Birinchidan, teskari transkripsiya samaradorligi PCRga qaraganda ancha past. Ikkinchidan, GKga boy mintaqa va ko'p genlarning ikkilamchi tuzilishi ham teskari transkripsiya, ham PCRni cheklaydi. Nihoyat, PCRning ishonchliligi va kuchaytirish samaradorligini bir vaqtning o'zida kafolatlash qiyin. Teskari transkripsiya jarayonida, hech kim past nusxali genlar uchun, ayniqsa oligo dT yordamida, uzun bo'lakka ega bo'lishni kafolatlay olmaydi. GC ko'p bo'lgan 5 'UTRga kelsak, bu yanada qiyinroq. Shunday qilib, tasodifiy primerlar yordamida transkriptni teskari yo'naltirish, maqsadli bo'lakda tabiiy bo'linish joylarini topish, segmentlar bo'yicha kuchaytirish va keyin cheklov hazm qilish va bog'lashni amalga oshirish oqilona usul. Umuman olganda, 2 kb dan katta bo'laklarni to'g'ridan -to'g'ri kuchaytirish qiyin, lekin uni olish har doim ham mumkin emas: 1. Birinchidan, RNK/mRNKning yaxlitligini kafolatlang va TRIZOL ekstraktsiyasiga ustunlik bering. 2.M-MLV RT-PCR to'plami to'g'ridan-to'g'ri ishlatilishi mumkin. Tozalash vaqtini uzaytiring va amplifikatsiya jarayonida tsikl sonini to'g'ri oshiring. Shu bilan bir qatorda, ichki PCR -ni qo'llash mumkin, yoki parchalarni uzaytirishga yordam beradigan normal PCR amplifikatsiyasidan oldin mos ravishda uzaytirilgan denaturatsiya va uzaytirish muddati bilan bir yoki ikkita reaktsiyani amalga oshirish mumkin. Polimeraza aniqligiga e'tibor bering. 3.Long Taq ideal natijalarga erishish uchun PCRda ishlatilishi mumkin. 4. Protein ekspresiyasini qo'llash uchun yuqori aniqlikdagi polimeraza qo'llanilishi kerak.

TIANGEN taklif qiladigan teskari transkriptazaning ikki turi mavjud: Quant/King RTase va TIANScript M-MLV. Ularning asosiy farqi shablonlarning kirish miqdori. Quant-bu noyob teskari transkriptaza, u Moloney murin leykemiya virusidan olingan keng tarqalgan M-MLVdan farq qiladi. Quant-bu Escherichia coli muhandisligi tomonidan rekombinant tarzda ifodalanadigan yuqori samarali yangi teskari transkriptaza. Quant yuqori teskari transkripsiya faolligi va yuqori rentabellikka ega 50 ng-2 mkg RNKni kuchaytirish uchun javob beradi. Oddiy MMLV yoki AMV bilan taqqoslaganda, Quantning eng katta xususiyati shundaki, u RNK shablonlari bilan juda kuchli yaqinlikka ega va yuqori harorat denaturatsiyasiz transkripsiya qilingan murakkab andozalarni teskari o'zgartirishi mumkin. GC tarkibi yuqori bo'lgan andozalar uchun teskari samaradorlik yuqori bo'ladi. Biroq, bu teskari transkriptaza RNase H faolligiga ega, bu cDNA mahsulotining uzunligiga ta'sir qilishi mumkin (<4,5 kb shablonlar uchun mos). An'anaviy teskari transkripsiya uchun TIANScript MMLV teskari transkriptaza tavsiya etiladi. Bu RTaz - juda zaif RNaz H faolligiga ega bo'lgan o'zgartirilgan ferment bo'lib, u uzoq (> 5 kb) cDNA sinteziga mos keladi.

Bir bosqichli teskari transkripsiya va PCR amplifikatsiyasi shu naychada cDNA sintezi va amplifikatsiyasi orasidagi naycha qopqog'ini ochmasdan tugallanadi, bu ifloslanishni kamaytirishga yordam beradi. Olingan barcha cDNA namunalari amplifikatsiya uchun ishlatilganligi sababli, sezuvchanlik yuqori, umumiy RNKning minimal 0,01 pg. Muvaffaqiyatli bir bosqichli RTPCR uchun genga xos primerlar odatda cDNA sintezini boshlash uchun ishlatiladi. Ikki bosqichli usul, ya'ni teskari transkripsiya va PCRni kuchaytirish ikki bosqichda amalga oshiriladi. Birinchidan, teskari transkripsiya cDNA olish uchun RNK shablonidan o'tkaziladi va olingan cDNA bir yoki bir nechta PCR reaktsiyalariga uchraydi. Ikki bosqichli usulda oDGO yoki tasodifiy primerlardan foydalanib, cDNKning birinchi zanjiri sintezini boshqarishi mumkin va ma'lum bir namunadagi barcha mRNK ma'lumotlarini teskari transkripsiya qilish mumkin.