Saytga yo'naltirilgan mutagenez to'plami

Maqsad vektorida maqsadli genning bir yoki ko'p saytli mutatsiyalari.

In vitro saytga yo'naltirilgan mutagenez-bu biologiya va tibbiyotning turli sohalarida muhim eksperimental usul bo'lib, u asosan maqsadli genlarni o'zgartirish va optimallashtirish, targ'ibotchilarning regulyativ saytlarini o'rganish, shuningdek oqsil tuzilishi va funktsiyasi o'rtasidagi murakkab munosabatlarni o'rganish uchun ishlatiladi. To'plam bitta sayt mutatsiyasini, ko'p saytli mutatsiyani, shuningdek maqsadli genga kiritish yoki o'chirish mutatsiyasini to'g'ridan-to'g'ri amalga oshirish uchun zamonaviy etakchi texnologiyani qo'llaydi. Bir joyli mutatsiyaning tezligi 90%dan oshishi mumkin. Bundan tashqari, an'anaviy mutatsion to'plamlardan farqli o'laroq, PCRning ko'p turlarini, klonlashtirishni va boshqa ko'p vaqt va mehnat talab qiladigan bosqichlarni talab qiladigan bo'lsak, to'plamning ishlashi osonroq va mutant shtammni yaratish uchun atigi to'rtta qadam kerak.

Mushuk Yo'q	Paket hajmi
44992901	20 rxn

Bizga elektron pochta xabarini yuboring

Mahsulot detallari

Tss

Mahsulot teglari

Xususiyatlari

■ Oddiy va tez: To'plam plazmidi bo'lmagan zanjir o'rnini bosuvchi texnologiyani qabul qiladi. Yovvoyi turdan mutant shtammga o'tishni amalga oshirish uchun faqat 4 qadam kerak bo'ladi, ko'p vaqtli va ko'p mehnat talab etuvchi qadamlarsiz, masalan, PCR va subklonlash.
■ Yuqori mahsuldorlikdagi astar: To'plam qisman bir-biriga o'xshash primer dizayni tamoyilini qabul qiladi, shuning uchun ko'proq mutant plazmidlarni kuchaytirish orqali olish mumkin.
■ Keng tarqalgan: to'plam nafaqat bitta saytli mutatsiyani, balki ko'p joyli mutatsiyani ham bajarishi mumkin. U 5 tagacha saytni mutatsiyaga keltirishi mumkin.
■ Kuchli moslashuvchanlik: To'plam maksimal 10 kb hajmli plazmidlarda saytga yo'naltirilgan mutatsiyani amalga oshirishi mumkin, bu asosan hamma ishlatiladigan plazmidlarni qamrab oladi.
■ Mutatsiyaning yuqori tezligi: komplektda in vitro va in vivo holatida metillangan plazmid shablonlarini ikki marta hazm qilish funktsiyasi mavjud bo'lib, bu mutatsiyaning yuqori tezligini ta'minlaydi.

Sayt-mutatsion reaktsiyasini o'rnatish va PCR dasturi

■ Yagona primer ko'p saytli mutatsiya uchun mutatsiya tezligi bitta sayt mutatsiyasidan past bo'ladi, chunki mutatsiya joylari soni ko'paygan. Bizning eksperimental ma'lumotlarga ko'ra, mutatsiya joylari soni 5 ga yetganda, mutatsiyaning ijobiy darajasi 50%gacha kamayadi. Shuning uchun, bu holatda, tasdiqlangan klonlar sonini ko'paytirish tavsiya etiladi.
■ To'plam ko'p primerli ko'p joyli mutatsiyani qo'llab-quvvatlaydi, shuning uchun mutatsiyalar bo'yicha tajribalar bir vaqtning o'zida kengroq genlarda o'tkazilishi mumkin. Mutatsiya joylari sonining yuqori chegarasi hali ham 5.
■ Eksperimental muammolarni tahlil qilishni osonlashtirish uchun yangi mutatsion tajribalarni o'tkazishda komplektdagi nazorat plazmidlari va primerlarini qo'llash tavsiya etiladi.

Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

Barcha mahsulotlar ODM/OEM uchun moslashtirilishi mumkin. Tafsilotlar uchun,Iltimos, moslashtirilgan xizmatni (ODM/OEM) bosing

Oldingi: To'g'ridan -to'g'ri PCR to'plami

Keyingi: 2 × Pfu PCR aralashmasi

Savol: Kuchaytiruvchi bantlar yo'q

A-1 shablon

■ Andoza tarkibida oqsil aralashmalari yoki Taq ingibitorlari va boshqalar mavjud. - DNK shablonini tozalang, oqsil aralashmalarini olib tashlang yoki tozalash to'plamlari yordamida DNK shablonini oling.

■ Shablonning denaturatsiyasi to'liq emas - Denaturatsiya haroratini mos ravishda oshiring va denaturatsiya vaqtini uzaytiring.

■ Andoza degradatsiyasi-shablonni qayta tayyorlang.

A-2 astar

■ Astarlarning sifati past--astarni qayta sintez qiling.

■ Primer degradatsiyasi - Konserva qilish uchun yuqori konsentratsiyali primerlarni kichik hajmga bo'ling. Ko'p muzlatish va eritishdan saqlaning yoki uzoq vaqt davomida 4 ° C haroratda saqlang.

■ Astarlarning noto'g'ri dizayni (masalan, astar uzunligi etarli emas, primerlar o'rtasida dimer hosil qilingan va hokazo) -Qayta loyihalash primerlari (primer dimer va ikkilamchi tuzilish shakllanishiga yo'l qo'ymaslik)

A-3 mg²⁺diqqat

■ Mg²⁺ konsentratsiyasi juda past - Mg ni muntazam oshirib boring²⁺konsentratsiyasi: Mg ni optimallashtirish²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

A-4 Tozalash harorati

■ Yuqori tavlanish harorati astar va shablonni bog'lashga ta'sir qiladi. —- Yonish haroratini pasaytiring va 2 ° C gradiyentli holatni optimallashtiring.

A-5 uzaytirish muddati

■ Qisqa muddat - - uzaytirish vaqtini ko'paytirish.

Savol: noto'g'ri ijobiy

Fenomenlar: Salbiy namunalar maqsadli ketma -ketlik tasmalarini ham ko'rsatadi.

A-1 PCRning ifloslanishi

■ Maqsadli ketma -ketlik yoki kuchaytiruvchi mahsulotlarning o'zaro ifloslanishi - salbiy namunadagi maqsadli ketma -ketlikdagi namunani naychalash yoki ularni santrifüj trubasidan to'kib yubormaslik. Reaktivlar yoki uskunalar mavjud nuklein kislotalarni yo'q qilish uchun avtoklavda bo'lishi kerak va ifloslanishning mavjudligini salbiy nazorat tajribalari orqali aniqlash kerak.

■ Reaktivlar bilan ifloslanish - reaktivlarni ko'paytirish va past haroratda saqlash.

A-2 boshr

■ Mg²⁺ konsentratsiyasi juda past - Mg ni muntazam oshirib boring²⁺ konsentratsiyasi: Mg ni optimallashtirish²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

■ Noto'g'ri astar dizayni va maqsadli ketma-ketlik nodavlat ketma-ketlik bilan gomologiyaga ega. —- Qayta dizayndagi astarlar.

Savol: Noma'lum kuchaytirish

Fenomenlar: PCR amplifikatsiya diapazonlari kutilgan hajmga mos kelmaydi, ham katta, ham kichik, yoki ba'zida o'ziga xos kuchaytiruvchi diapazonlar ham, o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish tasmalari ham paydo bo'ladi.

A-1 astar

■ Primerning o'ziga xosligi past

—- Qayta dizayndagi astar.

■ Primer kontsentratsiyasi juda yuqori - denaturatsiya haroratini to'g'ri oshiring va denaturatsiya vaqtini uzaytiring.

A-2 mg²⁺ diqqat

■ Mg²⁺ konsentratsiya juda yuqori - Mg2+ konsentratsiyasini to'g'ri kamaytiring: Mg ni optimallashtiring²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

A-3 termostabil polimeraza

■ Ortiqcha ferment miqdori - 0,5 U oralig'ida ferment miqdorini mos ravishda kamaytiring.

A-4 Tozalash harorati

■ Qovurish harorati juda past--Tavlanish haroratini mos ravishda oshiring yoki ikki bosqichli tavlanish usulini qo'llang.

A-5 PCR tsikllari

■ PCR tsikllari juda ko'p - PCR tsikllari sonini kamaytiring.

Savol: Yopishqoq yoki smear bantlar

A-1 astar—— Yomon o'ziga xoslik--Astarni qayta loyihalash, o'ziga xosligini oshirish uchun uning o'rnini va uzunligini o'zgartirish; yoki joylashtirilgan PCRni bajaring.

A-2 DNK shablonni

—– Shablon toza emas - Shablonni tozalang yoki DNKni tozalash to'plamlari bilan chiqarib oling.

A-3 mg²⁺ diqqat

——Mg²⁺ konsentratsiyasi juda yuqori - Mgni to'g'ri kamaytiring²⁺ konsentratsiyasi: Mg ni optimallashtirish²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

A-4 dNTP

DNTP konsentratsiyasi juda yuqori - DNTP konsentratsiyasini mos ravishda kamaytiring

A-5 Tozalash harorati

—- Juda past tavlanish harorati —- Tavlanish haroratini mos ravishda oshiring

A-6 davrlari

—— Juda ko'p tsikl - - Tsikl sonini optimallashtiring

Savol: 50 ml PCR reaktsiya tizimiga qancha shablon DNK qo'shilishi kerak?

Savol: Uzoq bo'laklarni qanday kuchaytirish kerak?

Birinchi qadam - tegishli polimeraza tanlash. Muntazam Taq polimeraza 3'-5 'ekzonukleaza faolligi yo'qligi sababli tekshira olmaydi va mos kelmaslik parchalarning kengayish samaradorligini ancha pasaytiradi. Shuning uchun muntazam Taq polimeraza 5 kb dan katta maqsadli bo'laklarni samarali ravishda kuchaytira olmaydi. Maxsus modifikatsiyali yoki boshqa yuqori aniqlikdagi polimerazali tak polimeraza kengayish samaradorligini oshirish va uzun bo'laklarni kuchaytirish ehtiyojlarini qondirish uchun tanlanishi kerak. Bundan tashqari, uzun bo'laklarni kuchaytirish uchun primer konstruktsiyasini, denaturatsiya vaqtini, uzaytirish vaqtini, bufer pH ni va boshqalarni moslashtirish talab qilinadi. Shabloni shikastlanishining oldini olish uchun, 94 ° C haroratda denaturatsiya vaqti har bir tsiklda 30 sekundgacha yoki undan kamgacha kamaytirilishi kerak, va kuchaytirishdan oldin haroratni 94 ° C ga ko'tarish vaqti 1 minutdan kam bo'lishi kerak. Bundan tashqari, cho'zish haroratini taxminan 68 ° C darajasida o'rnatish va 1 kb/min tezlik bo'yicha uzaytirish vaqtini loyihalash uzun bo'laklarning samarali kuchayishini ta'minlaydi.

Savol: PCR amplifikatsiyasining ishonchliligini qanday yaxshilash mumkin?

PCR amplifikatsiyasining xato tezligini turli xil DNK polimerazalari yordamida yuqori aniqlik bilan kamaytirish mumkin. Hozirgacha topilgan Taq DNK polimerazalari orasida Pfu fermenti xato darajasi past va ishonchliligi yuqori (biriktirilgan jadvalga qarang). Tadqiqotchilar fermentlarni tanlashdan tashqari, reaksiya sharoitlarini optimallashtirish, shu jumladan bufer tarkibini, termostabil polimeraza kontsentratsiyasini va PCR tsiklini optimallashtirish orqali PCR mutatsiyasini tezligini kamaytirishi mumkin.

Xabaringizni bu erga yozing va bizga yuboring