Qon to'g'ridan -to'g'ri PCR to'plami

Maqsad genini ekstraktsiyasiz shablon sifatida to'g'ridan -to'g'ri ishlatib, tez amplifikatsiya qilish.

Ushbu to'plam inson genomidagi bir nusxali genlarni samarali ravishda kuchaytirish uchun genetik muhandislik anti-inhibitori DNK polimerazasini qabul qiladi. Bu to'plamdagi yaxshi optimallashtirilgan tampon tizimi polimeraza PCR inhibitörlerinin inhibisyonuna kuchli qarshilik ko'rsatishga yordam beradi, shuning uchun shablon sifatida qon va madaniy hujayralar yordamida DNKni to'g'ridan -to'g'ri kuchaytirishi mumkin. Bu mahsulotni ishlatish oson va DNKni tozalash yoki namunani oldindan davolash kabi murakkab bosqichlarni talab qilmaydi.
Ushbu to'plam 2 × MasterMix sifatida taqdim etilgan va reaktsiya faqat qon shablonini va unga mos keladigan aniqlovchi primerlarni qo'shish orqali amalga oshirilishi mumkin. U odamlar, sichqonlar, cho'chqalar, qoramollar va boshqa turlar kabi sutemizuvchilarning o'stirilgan hujayralariga, shuningdek, yangi yoki 4 ℃ krioproservalangan butun qon, antikoagulyant (EDTA, sitrat, geparin), suyultirilgan qon quyqalari va quruq qonli dog'larga qo'llanilishi mumkin. Whatman 903 va FTA Elute savdo kartalarida saqlanadi.

Mushuk Yo'q	Paket hajmi
4992529	20 ml × 100 rxn
4992530	20 ml × 500 rxn

Bizga elektron pochta xabarini yuboring

Mahsulot detallari

Eksperimental misol

Tss

Mahsulot teglari

Xususiyatlari

■ Oddiy va tez: PCR amplifikatsiyasi namunani tayyorlash va DNKni ajratishning zerikarli bosqichlarini talab qilmasdan, to'g'ridan -to'g'ri shablon sifatida qon yordamida amalga oshirilishi mumkin.
■ Yuqori poklik: namunalarni oldindan davolash va DNKni ajratish bosqichlarini o'tkazib yuborish namunalarning o'zaro ifloslanishining oldini olishga yordam beradi.
■ Yuqori o'tkazuvchanlik: keng ko'lamli namunalar uchun PCR identifikatsiyasini to'plamni 96/384 quduqli PCR plitalari bilan birlashtirish orqali amalga oshirish mumkin.
■ Kuchli universallik: Bu to'plam yuqori darajali GC bo'laklarini yoki murakkab ikkilamchi tuzilishga ega bo'laklarni samarali ravishda kuchaytirishi mumkin va amplifikatsiya uzunligi 5 kb gacha bo'lishi mumkin.
■ Kuchli stress qarshiligi: Bu to'plam har xil turlarda saqlangan har xil turlar va qon namunalari uchun qo'llanilishi mumkin.

Ilovalar

Ushbu to'plamning PCR mahsulotlarida 3 'uchida "A" yozuvi mavjud bo'lib, uni to'g'ridan-to'g'ri TA vektorlarini klonlash uchun ishlatish mumkin. Bu to'plam genomik DNK bo'laklarini ko'paytirish, yuqori o'tkazuvchanlikdagi genetik tahlil va genotiplarni tahlil qilish (masalan, genlarni aniqlash) uchun ishlatilishi mumkin.

Barcha mahsulotlar ODM/OEM uchun moslashtirilishi mumkin. Tafsilotlar uchun,Iltimos, moslashtirilgan xizmatni (ODM/OEM) bosing

Oldingi: TIANcombi DNK Lyse va Det PCR to'plami

Keyingi: To'g'ridan -to'g'ri PCR to'plami

	Odamning EDTA antikoagulyatsiyasini shablon sifatida ishlatib, GC tarkibidagi 4 ta gen Blood Direct PCR to'plami yordamida kuchaytirildi. PCR reaktsiya tizimi 20 mkl edi va shablon sifatida 1 mkl qon ishlatilgan. M: TIANGEN marker II; 1: Fragment hajmi 1090 bp, GC tarkibi 68,1%; 2: Fragment hajmi 1915 bp, GC tarkibi 70,4%; 3: Fragment hajmi 448 bp, GC tarkibi 74,8%; 4: Fragment hajmi 1527 bp, GC tarkibi 61,5%. Eksperimental natijalar: Blood Direct PCR to'plami GN tarkibidagi DNK fragmentlarini 61,5%-74,8%oralig'ida samarali ravishda kuchaytirishi mumkin, bu uning yuqori GC bo'laklarini ko'paytirishga qodirligini ko'rsatadi.
	Odam EDTA antikoagulyatsiyasini shablon sifatida ishlatib, turli uzunlikdagi 5 ta gen (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 va Hn4.0) Blood Direct PCR to'plami yordamida kuchaytirildi. PCR reaktsiya tizimi 20 mkl edi va shablon sifatida 1 mkl qon ishlatilgan. M: TIANGEN marker II; 1-3: 3 xil qon namunalari; NTC: primersiz nazorat. Eksperimental natijalar: Blood Direct PCR to'plami 4 kb uzunlikdagi bo'laklarni kuchaytirishi mumkin, bu esa uning uzun bo'laklarni ko'paytirishga qodirligini ko'rsatadi.
	Odamning EDTA antikoagulyatsiyasini shablon sifatida ishlatib, turli xil qon namunalarini PCR orqali aniqlash uchun Blood Direct PCR to'plami ishlatilgan. PCR reaktsiya tizimi 20 mkl edi va shablon sifatida 1 mkl qon ishlatilgan. M: TIANGEN marker II; 1-9: qonning yuklanish miqdori mos ravishda 0,1 mkl, 0,2 mkl, 0,3 ml, 0,4 mkl, 1 mkl, 2 mkl, 3 mkl, 4 mkl va 5 mkl; NTC: shablonsiz boshqarish Eksperimental natijalar: Blood Direct PCR to'plami qonga kuchli qarshilik ko'rsatadi va yuklanish diapazoni 0,1-5 mkl bo'lgan qon namunalarini kuchaytirishi mumkin.
	Odamlar, kalamush, tovuq va boshqa turlardan olingan qon namunalari shablon sifatida ishlatilgan. Qon to'g'ridan-to'g'ri PCR to'plami PRNP (odam, 750 bp), aktin (kalamush, 200 bp) va b-aktin (tovuq, 1.0 kb) ni kuchaytirish uchun ishlatilgan. PCR reaktsiya tizimi 20 mkl edi va shablon sifatida 1 mkl qon ishlatilgan. M: TIANGEN Marker II. Eksperimental natijalar: Qonni to'g'ridan -to'g'ri PCR to'plami keng ko'lamli namunalarda qo'llanilishi mumkin va to'g'ridan -to'g'ri PCR aniqlanishi har xil turdagi har xil turdagi qon namunalarida o'tkazilishi mumkin.

Savol: Kuchaytiruvchi bantlar yo'q

A-1 shablon

■ Andoza tarkibida oqsil aralashmalari yoki Taq ingibitorlari va boshqalar mavjud. - DNK shablonini tozalang, oqsil aralashmalarini olib tashlang yoki tozalash to'plamlari yordamida DNK shablonini oling.

■ Shablonning denaturatsiyasi to'liq emas - Denaturatsiya haroratini mos ravishda oshiring va denaturatsiya vaqtini uzaytiring.

■ Andoza degradatsiyasi-shablonni qayta tayyorlang.

A-2 astar

■ Astarlarning sifati past--astarni qayta sintez qiling.

■ Primer degradatsiyasi - Konserva qilish uchun yuqori konsentratsiyali primerlarni kichik hajmga bo'ling. Ko'p muzlatish va eritishdan saqlaning yoki uzoq vaqt davomida 4 ° C haroratda saqlang.

■ Astarlarning noto'g'ri dizayni (masalan, astar uzunligi etarli emas, primerlar o'rtasida dimer hosil qilingan va hokazo) -Qayta loyihalash primerlari (primer dimer va ikkilamchi tuzilish shakllanishiga yo'l qo'ymaslik)

A-3 mg²⁺diqqat

■ Mg²⁺ konsentratsiyasi juda past - Mg ni muntazam oshirib boring²⁺konsentratsiyasi: Mg ni optimallashtirish²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

A-4 Tozalash harorati

■ Yuqori tavlanish harorati astar va shablonni bog'lashga ta'sir qiladi. —- Yonish haroratini pasaytiring va 2 ° C gradiyentli holatni optimallashtiring.

A-5 uzaytirish muddati

■ Qisqa muddat - - uzaytirish vaqtini ko'paytirish.

Savol: noto'g'ri ijobiy

Fenomenlar: Salbiy namunalar maqsadli ketma -ketlik tasmalarini ham ko'rsatadi.

A-1 PCRning ifloslanishi

■ Maqsadli ketma -ketlik yoki kuchaytiruvchi mahsulotlarning o'zaro ifloslanishi - salbiy namunadagi maqsadli ketma -ketlikdagi namunani naychalash yoki ularni santrifüj trubasidan to'kib yubormaslik. Reaktivlar yoki uskunalar mavjud nuklein kislotalarni yo'q qilish uchun avtoklavda bo'lishi kerak va ifloslanishning mavjudligini salbiy nazorat tajribalari orqali aniqlash kerak.

■ Reaktivlar bilan ifloslanish - reaktivlarni ko'paytirish va past haroratda saqlash.

A-2 boshr

■ Mg²⁺ konsentratsiyasi juda past - Mg ni muntazam oshirib boring²⁺ konsentratsiyasi: Mg ni optimallashtirish²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

■ Noto'g'ri astar dizayni va maqsadli ketma-ketlik nodavlat ketma-ketlik bilan gomologiyaga ega. —- Qayta dizayndagi astarlar.

Savol: Noma'lum kuchaytirish

Fenomenlar: PCR amplifikatsiya diapazonlari kutilgan hajmga mos kelmaydi, ham katta, ham kichik, yoki ba'zida o'ziga xos kuchaytiruvchi diapazonlar ham, o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish tasmalari ham paydo bo'ladi.

A-1 astar

■ Primerning o'ziga xosligi past

—- Qayta dizayndagi astar.

■ Primer kontsentratsiyasi juda yuqori - denaturatsiya haroratini to'g'ri oshiring va denaturatsiya vaqtini uzaytiring.

A-2 mg²⁺ diqqat

■ Mg²⁺ konsentratsiya juda yuqori - Mg2+ konsentratsiyasini to'g'ri kamaytiring: Mg ni optimallashtiring²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

A-3 termostabil polimeraza

■ Ortiqcha ferment miqdori - 0,5 U oralig'ida ferment miqdorini mos ravishda kamaytiring.

A-4 Tozalash harorati

■ Qovurish harorati juda past--Tavlanish haroratini mos ravishda oshiring yoki ikki bosqichli tavlanish usulini qo'llang.

A-5 PCR tsikllari

■ PCR tsikllari juda ko'p - PCR tsikllari sonini kamaytiring.

Savol: Yopishqoq yoki smear bantlar

A-1 astar—— Yomon o'ziga xoslik--Astarni qayta loyihalash, o'ziga xosligini oshirish uchun uning o'rnini va uzunligini o'zgartirish; yoki joylashtirilgan PCRni bajaring.

A-2 DNK shablonni

—– Shablon toza emas - Shablonni tozalang yoki DNKni tozalash to'plamlari bilan chiqarib oling.

A-3 mg²⁺ diqqat

——Mg²⁺ konsentratsiyasi juda yuqori - Mgni to'g'ri kamaytiring²⁺ konsentratsiyasi: Mg ni optimallashtirish²⁺ optimal Mg ni aniqlash uchun 0,5 mM oralig'ida 1 mM dan 3 mM gacha bo'lgan ketma -ket reaktsiyalar orqali konsentratsiyani²⁺ har bir shablon va astar uchun konsentratsiya.

A-4 dNTP

DNTP konsentratsiyasi juda yuqori - DNTP konsentratsiyasini mos ravishda kamaytiring

A-5 Tozalash harorati

—- Juda past tavlanish harorati —- Tavlanish haroratini mos ravishda oshiring

A-6 davrlari

—— Juda ko'p tsikl - - Tsikl sonini optimallashtiring

Savol: 50 ml PCR reaktsiya tizimiga qancha shablon DNK qo'shilishi kerak?

Savol: Uzoq bo'laklarni qanday kuchaytirish kerak?

Birinchi qadam - tegishli polimeraza tanlash. Muntazam Taq polimeraza 3'-5 'ekzonukleaza faolligi yo'qligi sababli tekshira olmaydi va mos kelmaslik parchalarning kengayish samaradorligini ancha pasaytiradi. Shuning uchun muntazam Taq polimeraza 5 kb dan katta maqsadli bo'laklarni samarali ravishda kuchaytira olmaydi. Maxsus modifikatsiyali yoki boshqa yuqori aniqlikdagi polimerazali tak polimeraza kengayish samaradorligini oshirish va uzun bo'laklarni kuchaytirish ehtiyojlarini qondirish uchun tanlanishi kerak. Bundan tashqari, uzun bo'laklarni kuchaytirish uchun primer konstruktsiyasini, denaturatsiya vaqtini, uzaytirish vaqtini, bufer pH ni va boshqalarni moslashtirish talab qilinadi. Shabloni shikastlanishining oldini olish uchun, 94 ° C haroratda denaturatsiya vaqti har bir tsiklda 30 sekundgacha yoki undan kamgacha kamaytirilishi kerak, va kuchaytirishdan oldin haroratni 94 ° C ga ko'tarish vaqti 1 minutdan kam bo'lishi kerak. Bundan tashqari, cho'zish haroratini taxminan 68 ° C darajasida o'rnatish va 1 kb/min tezlik bo'yicha uzaytirish vaqtini loyihalash uzun bo'laklarning samarali kuchayishini ta'minlaydi.

Savol: PCR amplifikatsiyasining ishonchliligini qanday yaxshilash mumkin?

PCR amplifikatsiyasining xato tezligini turli xil DNK polimerazalari yordamida yuqori aniqlik bilan kamaytirish mumkin. Hozirgacha topilgan Taq DNK polimerazalari orasida Pfu fermenti xato darajasi past va ishonchliligi yuqori (biriktirilgan jadvalga qarang). Tadqiqotchilar fermentlarni tanlashdan tashqari, reaksiya sharoitlarini optimallashtirish, shu jumladan bufer tarkibini, termostabil polimeraza kontsentratsiyasini va PCR tsiklini optimallashtirish orqali PCR mutatsiyasini tezligini kamaytirishi mumkin.

Xabaringizni bu erga yozing va bizga yuboring